РІВНІ СТРУКТУРНОЇ ОРГАНІЗАЦІЇ БІЛКІВ, МЕТОДИ ЇХ ВИВЧЕННЯ

Методичні вказівки для самостійної

позааудиторної роботи студентів з теми №3:

“РІВНІ СТРУКТУРНОЇ ОРГАНІЗАЦІЇ БІЛКІВ,

МЕТОДИ ЇХ ВИВЧЕННЯ”

 

Актуальність теми: Знання будови білків, рівнів їх структурної організації є необхідним для засвоєння та розуміння їх фізико-хімічних властивостей і біологічних функцій, що знадобиться провізорам для подальшого вивчення властивостей, умов виділення, зберігання фармпрепаратів білково-пептидної природи, а також засвоєння механізмів їх терапевтичної дії. Саме нативна (третинна та четвертинна) структура білків забезпечують їх біологічні функції в організмі.

Тривалість заняття: 6 годин

Навчальна мета:

Знати: характеристику всіх рівнів структурної організації білків.

Вміти: записати структурну формулу пептиду за відомим амінокислотним складом.

Засвоїти практичні навички: розрізняти методи вивчення рівнів структурної організації білків.

Базові знання

Дисципліна Отримані навички
Фізична та колоїдна хімія

 

Органічна хімія

 

Знати фізико-хімічні властивості амінокислот та білків

Знати формули основних протеїногенних амінокислот

 

Контрольні питання:

  1. Біологічні функції білків.
  2. Рівні структурної організації білків:

–                      Первинна структура білка, методи її встановлення. Роль ковалентних зв’язків;

–                      Вторинна структура білка. Роль водневих зв’язків;

–                      Третинна та четвертинна структури білка. Характеристика зв’язків, що їх утворюють.

  1. Методи виділення білків з біологічних об’єктів.
  2. Методи фракціонування білків:

–                      Ультрацентрифугування;

–                      Хроматографія (гель-фільтрація, іонообмінна, афінна, розподільча);

–                      Електрофорез та його використання в клінічній практиці.

  1. Молекулярна маса білків та методи її вивчення (седиментаційний аналіз, гель-хроматографія, електрофорез тощо).
  2. Методи вивчення первинної структури білків (методи Сенгера, Едмана, Акаборі, метод складання пептидних карт тощо).

 

Конспект теми:

Білки– полімери, мономерами яких є залишки альфа-амінокислот L-ряду, з’єднані між собою за допомогою пептидних зв’язків.

Первинна структура білка – це послідовність амінокислотних залишків у поліпептидному ланцюгу. Первинна структура визначає порядок розміщення амінокислотних залишків у молекулі білка. Вона стабілізується за допомогою пептидних зв’язків.

 

 

 

Схема утворення пептидного зв’язку:

 

Вторинна структура білкової молекули – це певний вид конфігурації, характерний для одного чи кількох поліпептидних ланцюгів, що входять до складу молекули. Розрізняють три основних типи (види) вторинної структури білка: альфа-спіраль, бета-структура та колагенова спіраль.

У стабілізації вторинної структури типу альфа-спіралі важливу роль відіграють водневі зв’язки, які виникають між карбонільним атомом кисню першого пептидного зв’язку і атомом водню, що з’єднаний з електронегативним атомом азоту четвертої від нього амінокислоти і направлені вздовж осі спіралі. Бета структура характерна для фібрилярних білків (бета-кератин, супероксиддисмутаза, карбоксипептидаза тощо). Цей тип вторинної структури також стабілізується водневими зв’язками, які виникають між відповідними С=О та N-H групами паралельних ланцюгів.

 

Рис. Рівні структурної організації білка

 

Колагенова спіраль складається з трьох однакових лівозакручених ланцюгів, що утворюють правозакручену потрійну спіраль тропоколагену. Колагенова спіраль стабілізується водневими зв’язками між ланцюгами. Особливістю первинної структури колагену є наявність у його структурі амінокислот оксипроліну та оксилізину; кожна третя амінокислота – гліцин.

Третинна структура білка – утворення нативної компактної структури білка, що характеризується розмірами й певною формою. У формуванні третинної структури беруть участь ковалентні (дисульфідні мостики між залишками цистеїну) та нековалентні взаємодії утворені за рахунок бокових радикалів амінокислот: гідрофобні взаємодії (між боковими радикалами гідрофобних амінокислот – Фен, Вал, Лей, Іле, Ала); іон-іонні або електростатичні взаємодії (між радикалами Асп, Глу та Арг, Гіс, Ліз), водневі (між радикалами залишків Сер, Тре, Тир і Глу і Асп, Глн, Асн, які не беруть участь у пептидних зв’язках).

Четвертинна структура білка – це спосіб об’єднання і розташування у просторі окремих поліпептидних ланцюгів, що входять до складу однієї молекули. Отже, четвертинна структура є лише у тих білків, молекули яких складаються з кількох поліпептидних ланцюгів. Наприклад, білок гемоглобін складається з чотирьох поліпептидних ланцюгів двох типів: альфа- (141 амінокислотний залишок) і бета- (146 амінокислотних залишків). Фермент РНК-полімераза складається з п’яти субодиниць. У формуванні четвертинної структури беруть участь слабкі взаємодії (водневі зв’язки, електростатичні, ван-дер-ваальсові та гідрофобні взаємодії).

 

МЕТОДИ ВИДІЛЕННЯ ТА ФРАКЦІОНУВАННЯ БІЛКІВ

Виділення індивідуальних білків із тканин, клітин та біологічних рідин живих організмів (тварин, рослин, бактерій, сироватки крові людини) є розповсюдженою біохімічною та біотехнологічною процедурою, що широко застосовується з метою отримання лікарських засобів (гормонів, ферментів, інтерферонів) або дослідження властивостей певних білків в аналітичній біохімії.

Виділення білків

Для виділення білків із біологічних об’єктів найчастіше використовують їх екстрагування за допомогою різних розчинників, вибір яких залежить від фізико-хімічних властивостей білка або групи білків, яку потрібно отримати. У разі необхідності одержання білків, що локалізовані в певних субклітинних органелах та зв’язані з біоструктурами (мембранами, ядерним хроматином тощо), процедура виділення білка включає в себе:

a)     руйнування тканинних та клітинних структур (гомогенізація тканини, механічне розтирання, осмотичний шок);

b)    диференційне центрифугування тканинних гомогенатів з метою отримання ізольованих фракцій ядер, мітохондрій, мембран ендоплазматичного ретикулуму, лізосом тощо;

c)     переведення білків субклітинних фракцій у розчинний стан шляхом обробки біоструктур детергентами або сольовими розчинниками;

d)    осадження білків шляхом висолювання або застосування таких дегідратуючих реагентів, як етанол (метод Кона), ацетон.

Фракціонування білків

Результатом вищезазначених біохімічних процедур є, як правило, отримання екстрактів, в яких міститься значна кількість різних білків та небілкових компонентів. Тому наступним етапом виділення індивідуальних білків є фракціонування білкових сумішей, яке здійснюється на основі відмінностей у фізико-хімічних властивостях індивідуальних білків (молекулярній масі, заряді, розчинності, хімічній та біохімічній активності). Ці ж методи дозволяють проводити визначення і відповідних фізико-хімічних параметрів певних білкових молекул.

Методи фракціонування:

Методи, що базуються на відмінностях у молекулярній масі білків:

– метод ультрацентрифугування (седиментаційного аналізу).

Метод ґрунтується на застосуванні швидкісних ультрацентрифуг, за допомогою яких білкові молекули (або інші високомолекулярні сполуки) зазнають дії відцентрового прискорення, яке в сотні тисяч разів перевищує прискорення земного тяжіння (100000-500000 g). Внаслідок дії значної відцентрової сили, макромолекули осідають (седиментують) із швидкістю, яка залежить від їх розмірів та молекулярної маси.

Визначення швидкості седиментації білкової молекули, яка виражається коефіцієнтом седиментації s, дозволяє обчислити молекулярну масу білка (М) за рівнянням Сведберга:

,

де R – газова стала, Т – абсолютна температура, s – коефіцієнт седиментації, D – коефіцієнт дифузії білка, v – парціальний питомий об’єм білка, р – густина розчинника.

– метод гель-фільтрації (гель-хроматографії).

В основу методу покладено відмінності у швидкостях проходження (фільтрації) білкових молекул, що відрізняються молекулярними масами, через спеціальні гелі, які відіграють роль молекулярних сит. Для гель-фільтрації застосовують полімерні сполуки, найчастіше – похідні полісахариду декстрану (комерційна назва – Сефадекси), що мають форму гранул із порами певного розміру. Під час проходження через хроматографічну колонку, яка містить гранули Сефадексу, суміші білків та інших хімічних сполук відбувається фракціонування останніх залежно від розмірів молекул та, відповідно, здатності до проникнення в сітку гелю. Швидкість проходження різних молекул через молекулярні сита обернено пропорційна їх розмірам та молекулярним масам.

Методи, що базуються на відмінностях у кислотно-основних властивостях білків.

Амфіонні властивості білків дозволяють здійснювати їх фракціонування методами іонообмінної хроматографії та електрофорезу. Метод іонообмінної хроматографії базується на здатності заряджених молекул білків вибірково зв’язуватися за допомогою іонного обміну з певними ділянками іонообмінників. Фракціонування компонентів білкових сумішей досягається шляхом пропускання буферних розчинів білків при різних значеннях рН через хроматографічні колонки, що містять катіоно- або аніонообмінники.

Із метою хроматографічного розділення білків шляхом іонного обміну найчастіше використовують іонообмінники на основі целюлози: катіонообмінник – діетиламіноетилцелюлозу (ДЕАЕ-целюлозу) або аніонообмінник – карбоксиметилцелюлозу (КМ-целюлозу).

Методи, що базуються на відмінностях у біохімічній активності індивідуальних білків.

Ця група методів ґрунтується на використанні різної спорідненості природних білків до певних хімічних лігандів, з якими окремі білкові молекули активно взаємодіють у живих організмах – хроматографія за спорідненістю, або афінна хроматографія.

Для реалізації методу афінної хроматографії суміш білків пропускають через хроматографічну колонку, що містить природні ліганди для білка, який потрібно виділити із складної біологічної суміші. Наприклад, для виділення ферментів застосовують їх специфічне зв’язування із субстратами, гормонів – із рецепторами, імуноглобулінів – з відповідними антигенами.

Методи визначення амінокислотного складу та

первинної структури білків і пептидів

Вивчення амінокислотного складу білків

Дослідження амінокислотного складу (ідентифікація окремих амінокислотних залишків та з’ясування їх кількісного складу) є першим етапом у визначенні первинної структури білка чи пептиду.

Етапи вивчення амінокислотного складу білків (пептидів):

а) гідроліз пептидного ланцюга досліджуваного білка чи пептиду. Гідроліз пептидного ланцюга здійснюється шляхом кислотного розщеплення пептидних зв’язків. Стандартною процедурою гідролізу є кип’ятіння білка в соляній кислоті (5,7 моль/л) при 105-110 °С протягом 24 год.;

б) розділення амінокислот гідролізату. Здійснюється шляхом іонообмінної хроматографії компонентів гідролізату на сульфополістиролових смолах, що несуть на своїй поверхні катіонні угруповання – R-S03“Na+. При пропусканні через хроматографічну колонку, що заповнена сульфо-полістиролом, суміші амінокислот – останні сорбуються на певних рівнях колонки. Подальше промивання колонки буферними розчинами з різними значеннями рН призводить до вимивання (елюції) певних амінокислот;

в) ідентифікація та кількісне визначення окремих амінокислот. Здійснюється за допомогою реакції з нінгідрином або флуорескаміном, які дають при взаємодії з амінокислотами відповідні кольорові або флуоресціюючі комплекси.

Метод кількісного аналізу амінокислотного складу білків та пептидів був уперше запропонований у 1958 р. У. Стейном та С. Муром і нині реалізується за допомогою автоматичних амінокислотних аналізаторів.

 

Розшифровка первинної структури білків і пептидів

Визначення послідовності амінокислотних залишків у молекулах білків та пептидів (розшифровка первинної структури) складається з таких етапів:

1. Аналіз N– та С-кінцевих амінокислотних залишків.

Оскільки в поліпептидному ланцюгу, що формує первинну структуру будь-якого білка, на одному кінці розташована вільна NH2-гpyпa, а на другому – вільна карбоксильна група, визначення N- та С-кінцевих амінокислотних залишків дозволяє оцінити кількість поліпептидних ланцюгів, що складають дану білкову молекулу.

Ідентифікація N-кінцевих амінокислот здійснюється шляхом використання хімічних реагентів, що ковалентно зв’язуються з кінцевою α-амінною групою пептидного ланцюга. Після подальшого кислотного гідролізу “міченого” пептиду хімічно модифікований N-термінальний амінокислотний залишок ідентифікується хроматографічним методом.

Для модифікації N-кінцевих амінокислот у білках та пептидах застосовують такі реагенти:

2,4-динітрофторбензол (ДНФБ) – реагент, який, взаємодіючи з α-аміногрупою кінцевої амінокислоти, утворює ДНФ-похідну білка чи пептиду. Подальший кислотний гідроліз продукту арилування поліпептиду утворює суміш ДНФ-похідну N-кінцевої амінокислоти, (яку ідентифікують хроматографічно) та вільних амінокислот, що входять до складу досліджуваного білка;

 

Схема утворення ДНФ-похідних N-кінцевих амінокислот та пептидів.

 

дансил-хлорид (1-диметиламінонафталін-5-сульфохлорид, ДНС) – реагент, який в результаті взаємодії з N-кінцевою амінокислотою утворює ДНС-похідні білків. Завдяки подальшому кислотному гідролізу ДНС-поліпептидів відбувається хроматографічна ідентифікація ДНС-амінокислот.

Ідентифікація С-кінцевих амінокислот здійснюється шляхом ферментативного гідролізу білків та пептидів карбоксипептидазами – протеолітичними ферментами, що специфічно відщеплюють від поліпептидного ланцюга С-кінцеву амінокислоту.

 

Фрагментація поліпептидного ланцюга та розділення пептидних фрагментів

Розщеплення досліджуваного білка чи пептиду на короткі фрагменти здійснюється зазвичай методом ферментативного гідролізу із застосуванням протеолітичних ферментів трипсину, хімотрипсину або інших протеаз (пепсину, еластази, папаїну тощо). Пептидні фрагменти, що утворилися внаслідок гідролізу, складаються з 10-20 амінокислотних залишків і можуть розділятися за допомогою одного з хроматографічних методів (зокрема, методу високоефективної рідинної хроматографії – ВЕРХ) або методом електрофорезу.

 

Визначення амінокислотних послідовностей у пептидах

Основним сучасним методом розшифровки амінокислотних послідовностей є метод ступінчастої деградації поліпептидних ланцюгів за допомогою фенілізо-тіоціанату (ФІТЦ).

Він був запропонований шведським біохіміком П. Едманом (P. Edman) у 1950-1956 pp. і складається з таких етапів:

– взаємодія ФІТЦ з α-аміногрупою N-кінцевої амінокислоти досліджуваного пептиду з утворенням фенілтіокарбамоїл (ФТК)-пептиду;

– відщеплення в кислому середовищі від ФТК-пептиду фенілтіогідантоїнової похідної N-кінцевої амінокислоти та її ідентифікація.

Унікальною особливістю методу Едмана є послідовне вкорочення досліджуваного пептиду з N-кінця на один мономер без руйнування пептидних зв’язків між іншими амінокислотними залишками. Таким чином стають можливими повторення зазначеної послідовності операцій та аналіз усього пептиду шляхом поступового відщеплення його N-кінцевих амінокислотних залишків. Автоматизація методу, що реалізована в спеціальному приладі – “секвенаторі”, (від англ. – “sequence” – послідовність), дозволяє аналізувати з високою ефективністю продукти білкового гідролізу і природні пептиди.

 

 

Рис. Схема аналізу пептидів за методом П. Едмана

 

Матеріали для самоконтролю:

  1.  Первинна структура білка – це послідовність амінокислотних залишків у поліпептидному ланцюгу. За допомогою яких зв’язків вона стабілізується?

А. пептидних;       В. дисульфідних;            С. водневих;

D. складноефірних;          Е. іон-іонних взаємодій.

2. До складу колагенової спіралі входять такі амінокислоти, як оксипролін та оксилізин. Назвіть амінокислоту яка є кожною третьою в молекулі колагену:

А. гліцин;    В. глютамін;    С. гістидин;    D. лізин;    Е. пролін.

3. Пептидний зв’язок утворюється між амінокислотними залишками при взаємодії α-карбоксильної групи однієї амінокислоти з α-аміногрупою іншої амінокислоти. При цьому в залежності від умов пептидний зв’язок може перебувати у двох таутомерних формах, а саме:

А. кето- та енольній;             В. лактимній та лактамній;

С. оксо- та циклічній;   D. відновленій та окисленій;    Е. полімерній.

4. Метод сидементаційного аналізу фракціонування білків ґрунтується на дії відцентрового прискорення білкових молекул в ультрацентрифузі. Від чого буде залежати швидкість осідання макромолекул?

А. від розмірів та молекулярної маси;  В. від амінокислотного складу;  С. від сумарного заряду білкової молекули;   D. від рівня структурної організації білкової молекули;       Е. біохімічної активності.

5. Для аналізу білкових сумішей у лабораторіях часто застосовують методи фракціонування. У основі деяких з них лежить відмінність в молекулярній масі та розмірі білкових молекул. До таких методів належить:

А. гель-фільтрація;   В. афінна хроматографія;   С. електрофорез;

D. іонообмінна хроматографія;     Е. паперова хроматографія.

6. До методів фракціонування, що базуються на відмінностях у кислотно-основних властивостях білків відноситься метод іонообмінної хроматографії. При цьому використовуються іонообмінними на основі целюлози з різницею:

А. у значеннях рН;  В. у температурі;  С. у швидкості пропускання розчину;   D. у концентрації розчину білка;  Е. у електричному заряді іонообмінника.

7. Для виділення груп білків із певною біохімічною активністю використовується метод афінної хроматографії. Для якої групи білків використовують їх специфічне зв’язування з рецепторами:

А. гормонів;           В. ферментів;         С. імуноглобулінів;

D. протеогліканів;             Е. хромопротеїнів.

 

Рекомендована література:

  1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль, 2007. – С. 36-40, 166-172.
  2. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини.– Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – С. 15-44, 325-330.
  3. Мещишен І.Ф., Пішак В.П., Григор’єва Н.П. Основи обміну речовин та енергії. – Чернівці: Медакадемія, 2005. – Розділ 2.
  4. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия,1998. – С.49-71, 74.
  5. Бышевский А.Ш., Терсенов О.А. Биохимия для врача, 1994. – С.88-90.
  6. Мещишен І.Ф., Яремій І.М. Клініко-біохімічні ситуаційні задачі.-Чернівці: Медик, 2005. – 84с.
  7. Мещишен І.Ф. Задачі з біохімії та алгоритми їх розв’язування. – Чернівці: Медакадемія, 2001. – 152 с.

 

ЗАВАНТАЖИТИ

Для скачування файлів необхідно або Зареєструватись

РІВНІ СТРУКТУРНОЇ ОРГАНІЗАЦІЇ БІЛКІВ, МЕТОДИ ЇХ ВИВЧЕННЯ (89.4 KiB, Завантажень: 5)

завантаження...
WordPress: 22.86MB | MySQL:26 | 0,324sec