РЕГУЛЯЦІЯ ЕКСПРЕСІЇ ГЕНІВ. ГЕННІ МУТАЦІЇ. ГЕНЕТИЧНІ РЕКОМБІНАЦІЇ. ГЕННА ІНЖЕНЕРІЯ

Методичні вказівки для самостійної

позааудиторної роботи студентів з теми №23:

“РЕГУЛЯЦІЯ ЕКСПРЕСІЇ ГЕНІВ. ГЕННІ МУТАЦІЇ.

ГЕНЕТИЧНІ РЕКОМБІНАЦІЇ. ГЕННА ІНЖЕНЕРІЯ”

 

Актуальність теми:

Одним з основних шляхів адаптації організмів до зміни умов зовнішнього середовища – регуляція експресії генів. Експресія генетичної інформації регулюється в ході онтогенезу організму та диференціювання клітин, що його складають. Більше того, щоб організм міг пристосуватись до змін зовнішнього середовища для економії енергії та харчових речовин, система експресії генетичної інформації адаптується до зовнішних сигналів.

Тривалість заняття: 6 годин.

Навчальна мета:

Знати: особливості молекулярної організації та експресії геному в еукаріотів.

Вміти: провести ранню діагностику спадкових патологій (обміну амінокислот).

Засвоїти практичні навички: методика проведення ланцюгової плоімеразної реакції.

Базові знання

Дисципліна Отримані навички
Медична біологія Мутації

 

Контрольні питання:

1.Молекулярна організація ДНК еукаріотів (екзони, інтрони; послідовності, що повторюються).

2.Регуляція експресії генів еукаріотів на рівні транскрипції.

3.Генетичні рекомбінації; транспозони.

4.Рекомбінації геному прокаріотів (трансформація, трансдукція, кон’югація).

5.Процеси рекомбінації у еукаріотів на прикладі утворення генів H- та L-ланцюгів молекул імуноглобулінів.

6.Ампліфікація генів (гени металотіонеїну, дигідрофолатредуктази).

7.Ланцюгова полімеразна реакція; її використання в медицині.

8.Мутації: геномні, хромосомні, генні (точкові); роль у виникненні ензимопатії та спадкових хвороб людини.

9.Біохімічні механізми дії хімічних мутагенів – аналогів азотистих основ, дезамінуючих, алкілуючих агентів, ультрафіолетового та іонізуючого випромінювання.

10.Генна інженерія, або технологія рекомбінантних ДНК: загальні поняття, біомедичне значення.

11.Технологія трансплантації генів та отримання гібридних молекул ДНК; застосування рестрикційних ендонуклеаз.

12.Клонування генів з метою отримання біотехнологічних лікарських засобів та діагностикумів.

13.Спадкові ензімопатії та методи їх виявлення.

 

Конспект теми:

Як свідчать дані сучасної біохімії і молекулярної біології, за складом та субклітинною архітектурою еукаріотичні клітини суттєво відрізняються від клітин прокаріотів: так, кількість відомих індивідуальних білків в організмі людини перевищує 50 000, порівняно з приблизно 3 000 різних білків у Е. соїі. Відповідно, і геном ядерних організмів є складнішою системою за своєю структурою та молекулярною організацією, порівняно з прокаріотами, зокрема, значна різниця існує в кількісних показниках і структурній організації ДНК.

Відповідно до особливостей структурної організації геному, контроль експресії генів у еукаріотів також значно складніший. Окрім механізмів, близьких до існуючих у прокаріотів, в контролі генної експресії в еукаріотичних клітинах беруть участь такі специфічні молекулярні процеси, що реалізують регуляторну дію на різних рівнях генної експресії:

  • Ø на рівні структурної організації геному – регуляція здійснюється за рахунок наявності специфічних послідовностей нуклеотидів, генних перебудов (рекомбінації генів), ампліфікації генів;
  • Ø на рівні транскрипції – регуляторними механізмами є вплив сигналів посилення та послаблення транскрипції (енхансерів та атенюаторів, відповідно), посттранскрипційна модифікація мРНК;
  • Ø на рівні трансляції – основним механізмом регуляції є ковалентна модифікація білкових факторів трансляції шляхом їх зворотного фосфорилування-дефосфорилування.

Молекулярна організація ДНК еукаріотів

Гаплоїдний геном кожної клітини організму Homo sapiens містить 3,5х109 пар азотистих основ і складається з 23 пар хромосом, що є достатнім для утворення близько 1,5 млн пар генів. Разом з тим, реально в організмі людини синтезується не більше 100 000 різних білків, тобто більша частина ядерної ДНК, що складає геном людини, не транслюється в амінокислотну послідовність білкових молекул.

Наявність (крім регуляторних і сигнальних нуклеотидних послідовностей, присутніх також у прокаріотів) значної кількості ділянок, що не транскрибуються, є специфічною особливістю структури геному еукаріотичних клітин. Такі “мовчазні” фрагменти геному отримали назву інтронів, на відміну від екзонів — ділянок геному, які транскрибуються з утворенням мРНК, що несуть інформацію для синтезу специфічних клітинних білків.

Згідно з сучасними оцінками, тільки 2 % ДНК клітин ссавців містять інформацію для кодування білків організму.

Повторні послідовності ДНК

Вивчення нуклеотидних послідовностей ДНК вищих організмів виявило, крім унікальних за нуклеотидним складом послідовностей, розповсюдженість фрагментів, що присутні, зокрема в ДНК ссавців, у вигляді багатьох копій – від 2 до 107 повторів на клітину. В геномі людини повтори складають 20—30 % від його загальної довжини.

Залежно від кількості нуклеотидів і кратності їх повторення послідовності нуклеотидів, що повторюються, підрозділяються на такі класи:

(а)       високоповторювані послідовності, які є ділянками з довжиною від 5 до 500 парнуклеотидів, розташованими одна за одною (“тандемно”). Такі послідовності утворюють кластери, що містять від 1 до 10 млн копій і складають фракцію “сателітної ДНК”. Ці високоповторювані послідовності транскрипційно неактивні, і їх функціональну роль остаточно не з’ясовано;

(б)       помірноповторювані послідовності, які мають не більше ніж 106 копій і не утворюють тандемних кластерів, а чергуються з унікальними нуклеотидними послідовностями (“дисперговані повтори”). Ці послідовності мають різну довжину і можуть бути як короткими, так і довгими (у 5-7 тис. пар нуклеотидів).

Короткі дисперговані повтори – це фрагменти ДНК довжиною від одиниць (декількох пар) до декількох сотень пар нуклеотидів. До цього класу належать поширені в клітинах організму людини повтори сімейства Аlu, які мають довжину 300 пар нуклеотидів і повторюються в кількості близько 500000 копій, складаючи в цілому 3-6 % від загального розміру геному гаплоїдної клітини. Ці повтори можуть транскрибуватися у вигляді компонентів гяРНК та індивідуальних клітинних РНК – 4,5s- і 7s-PHK.

За своєю нуклеотидною структурою повтори Alu близькі до кінцевих послідовностей ретровірусів LTR і, ймовірно, мають з ними генетичний зв’язок. Вважають, що ці послідовності є мобільними елементами геному, що здатні до транспозиції, тобто вирізування і вбудови в різні ділянки геному.

Ядерний хроматин еукаріотів

Як уже зазначалося, структурною особливістю просторової будови ДНК еукаріотів є її компактизація у вигляді суперспіралей, які, в комплексі з гістонами та негістоновими білками – НГБ (до їх складу входять регуляторні, структурні білки, ферменти реплікації тощо) утворюють ядерний хроматин, які на етапі мітозу організується у вигляді хроматинових тілець – хромосом.

У клітинах тварин та людини реплікація ДНК відбувається тільки у певний період клітинного циклу – S-фазу, яка відокремлена від мітозу (М) пресинтетичною (G1) та постсинтетичною (G2) фазами; фази S, G1 та G2 складають “інтермітотичний період” – інтерфазу, Go – період репродуктивного спокою. Контрольні механізми, що регулюють перехід клітини з G1 до S-фази, залишаються недостатньо з’ясованими. Разом з тим, пускові реакції, які визначають початок мітозу і полягають у зворотному фосфорилуванні певних ядерних та цитоплазматичних білків, протягом останніх років у достатній мірі розшифровані.

В інтерфазному ядрі хроматин диференціюється на транскрипційно активний хроматин (TAX), або еухроматин, та транскрипційно неактивний, репресований хроматин (РХ), або гетерохроматин. Ці два типи хроматину розрізняють за біохімічними та морфологічними (електронномікроскопічними) характеристиками: TAX менш щільно компактизований, ніж РХ, його нуклеосомна структура змінена, а в транскрипційно найбільш активних регіонах взагалі відсутня.

Ковалентна модифікація гістонів та НГБ

Гістони та НГБ, що входять до складу нуклеосом хроматину, підлягають процесам посттрансляційної ковалентної модифікації, яка змінює їх хімічні властивості, зокрема здатність до взаємодії з певними ділянками ДНК, і може бути одним з біохімічних механізмів контролю ступеня експресії певних генів.

До реакцій ковалентної модифікації білків ядерного хроматину належать їх ацетилування, фосфорилування, метилування, глікозилування, АДФ-рибозилування. Негістонові білки підлягають постсинтетичним модифікаціям у значно більшому ступені, ніж гістони. Відповідні радикали (ацетильні, фосфорні, метильні, глікозильні, АДФ-рибозильні) сполучаються з боковими ланцюгами амінокислотних залишків у поліпептидних ланцюгах гістонів та НГБ. Слід визнати, що регуляторне значення в реалізації конкретних молекулярно-генетичних процесів точно не встановлене для жодного із зазначених шляхів ковалентної модифікації ядерних білків. Певні функціональні кореляції з активністю геному виявлені лише для реакцій ацетилування та фосфорилування.

Ацетилування гістонів – процес, що починається вже в цитоплазмі (ацетилування N-кінцевого серину гістону Н4) і завершується в ядрі, де ацетилуються переважно бокові радикали лізинових залишків, що призводить до зменшення позитивного заряду гістонів і розрихлення комплексів гістон-ДНК у складі нуклеосом. Ацетилування передує активації геному і зростанню швидкості транскрипції.

Фосфорилування-дефосфорилування білків хроматину (гідроксильних груп залишків серину та треоніну) – клас реакцій, що відбуваються як у цитоплазмі (безпосередньо після їх трансляції), так і в ядрі. Встановлено, що протягом різних фаз клітинного циклу зворотно фосфорилуються як гістони (Н1, Н3), так і окремі НГБ, проте для індивідуальних білків ці закономірності можуть бути різними.

Генетичні рекомбінації

Важливе місце в організації геному різних клітин посідають генні перебудови (реаранжування – rearrangements, англ.), або генетичні рекомбінації (рекомбінації генів), під якими розуміють обмін фрагментами ДНК між різними генами або об’єднання генів з різних біологічних джерел з утворенням нових хромосомних структур, здатних до реплікації і генетичної експресії (транскрипції та трансляції).

 

Рекомбінація відбувається в результаті фізичного розриву в хромосомах (М) та (F) і їх наступне з’єднання з утворенням двох нових хромосом (C1 і C2)

 

 

Генетичні рекомбінації мають місце в біологічних системах різного ступеня складності – від вірусів і бактеріофагів до вищих еукаріотичних організмів. Перебудови структури генів є рушійною силою мінливості і мають велике значення у формуванні біохімічної індивідуальності як на рівні окремих особин в межах біологічного виду, так і в утворенні видів у процесі еволюції.

Молекулярні механізми генетичних рекомбінацій складні і суттєво відрізняються у різних організмів та при різних типах рекомбінацій. Вони включають у себе ферментативні процеси “розрізання” молекул реципієнтних ДНК (за участю специфічних ДНК-аз) та включення в молекулу ДНК чужорідних полінуклеотидних фрагментів з іншої хромосоми, або з іншого локуса тієї ж хромосоми – так званих транспозонів (transpose — переміщати, англ.). Здатність транспозонів бути вбудованими в молекули інших ДНК залежить від присутності на кінцях транспозонів особливих нуклеотидних фрагментів – так званих інсерційних послідовностей (insert – вставляти, включати, англ.); наступне зшивання фрагментів ДНК-лігазами завершує процес перенесення гена.

Рекомбінації у прокаріотів

Рекомбінації є поширеним процесом у прокаріотичних організмів, завдяки якому клітини останніх включають до складу свого геному фрагменти ДНК (генетичні елементи) з інших клітин. До генетичних рекомбінацій у прокаріотів належать:

а) трансформація – процес включення в геном реципієнтного мікроорганізму ДНК з донорної загиблої клітини того ж виду;

б) трансдукція – перенос бактеріофагом фрагмента ДНК інфікованої клітини у склад геному іншогореципієнтного мікроорганізму;

в) кон’югація – процес статевого розмноження, що має місце у деяких видів бактерій і полягає в перенесенні фрагмента ДНК з донорної (F+) до реципієнтної (F) клітини.

Добре відомо, що вищі організми, які розмножуються статевим шляхом, формують спеціалізовані статеві клітини, або гамети – яйцеклітини та сперматозоїди. Цей процес передбачає зменшення (редукцію) числа хромосом вдвічі у ході гаметогенезу, що досягається спеціальним мейотичним поділом. При цьому перед вступом клітин-попередників гамет у редукційний етап мейозу відбувається кросинговер, тобто обмін ідентичними ділянками між гомологічними (парними) батьківськими хромосомами. За молекулярно-біологічними механізмами процес кросинговеру при гаметогенезі, що передує у вищих еукаріотів статевому розмноженню, являє собою обмін ділянками ДНК між гомологічними хромосомами. Таким чином, саме рекомбінація батьківських хромосом при утворенні гамет забезпечує появу в хромосомах нащадків нових комбінацій генів, тобто є найважливішим фактором комбінативної мінливості в людських популяціях.

Рекомбінації генів імуноглобулінів

У зрілих особин процеси переміщення (транслокації, транспозиції) окремих генів або груп генів в інше місце геному (в межах тієї ж хромосоми або в іншу хромосому) мають місце в генах В-лімфоцитів, що кодують утворення імуноглобулінів. Ці генетичні рекомбінації є механізмом, завдяки якому в організмі людини та тварин забезпечується синтез мільйонів різних антитіл у відповідь на проникнення в організм чужорідних антигенів.

Імуноглобуліни є білками тетрамерної будови, що складаються з чотирьох поліпептидних ланцюгів: двох Н- (“важких”) ланцюгів та двох L- (“легких”) ланцюгів, які є попарно однаковими. Розрізняють п’ять типів Н-ланцюгів (α – альфа, γ – гамма, µ – мю, δ – дельта, ε – епсилон) та два типи L-ланцюгів (κ – каппа та λ – лямбда). Залежно від типу легкого та важкого ланцюгів, розрізняють п’ять класів імуноглобулінів (IgG, IgA, IgM, IgD та IgE), у складі кожного з яких певний тип Н-ланцюга сполучається з одним із двох типів L-ланцюга.

У свою чергу, в кожному з Н- та L-ланцюгів молекул імуноглобулінів можна виділити окремі структурні домени: константні (С) ділянки, що розміщуються з С-кінців Н- та L-ланцюгів і характеризуються сталістю амінокислотного складу у різних класів імуноглобулінів, та варіабельні (V) ділянки, що розміщуються з N-кінців Н- та L-ланцюгів і характеризуються мінливістю амінокислотного складу, утворюючи конформації, комплементарні детермінантним групам антигенів, тобто забезпечуючи їх зв’язування з антитілами.

Саме завдяки наявності на кінцях L- та Н-ланцюгів імуноглобулінів варіабельних ділянок забезпечується можливість синтезу надзвичайно великої кількості індивідуальних імуноглобулінів (антитіл) відповідно до надходження чужорідних білкових молекул. У свою чергу, синтез такої значної кількості молекул з різною первинною структурою визначається множинними рекомбінаціями генів, що кодують окремі частини молекул імуноглобулінів.

Розглянемо основні закономірності генетичних рекомбінацій, що існують при формуванні в зрілих лімфоцитах генів, які кодують синтез L- та Н-ланцюгів імуноглобулінів.

L-ланцюги – синтез легких ланцюгів відбувається за рахунок експресії трьох сімейств генів, що утворюють варіабельний (VL), з’єднувальний (JL) та константний (CL) сегменти; зазначені три сімейства, що кодують синтез легких ланцюгів типу каппа, локалізовані в 2-й хромосомі, ланцюгів типу лямбда – у 22-й хромосомі.

У гаплоїдному хромосомному наборі міститься близько 500 генів сімейства VL, 5-6 генів типу JL та 10-20 генів типу CL. Ці генні сімейства локалізовані на відстані одне від одного в різних ділянках хромосом (2-ї та 22-ї, відповідно) і зближуються між собою в період утворення зрілого В-лімфоцита за рахунок перебудови ДНК і транслокації гена типу VL з дистальної ділянки хромосоми ближче до JL– та СL-сегментів. За рахунок такої перебудови утворюється єдиний генний локус, що має будову V JL(i)CL(i) і транскрибується у вигляді єдиного поліцистронного мРНК-попередника (первинного транскрипту), який після відповідного процесингу утворює зрілу мРНК для легкого ланцюга імуноглобулінів.

Н-ланцюги – синтез важких ланцюгів імуноглобулінів кодується генами чотирьох сімейств, що утворюють VH-, D-, JH– та Сн-сегменти у складі 14-ї хромосоми.

Генетичний локус, що кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга, формується за рахунок зближення генів із сімейств VH (250-350 генів), D (15-20 генів) та JH (4 гени). Генна детермінація синтезу цілісного важкого ланцюга відбувається за рахунок взаємодії локуса будови V DJ (що кодує варіабельну ділянку) з одним із восьми генів сімейства СН (що кодують константну ділянку).

Синтез лімфоцитами імуноглобулінів певних класів (G, А, М, D, Е), що розрізняються за типом будови важкого ланцюга, забезпечується за рахунок функціонування механізму “переключення класів важких імуноглобулінів”, який здійснюється шляхом фіксації в структурі геному певного з обраних Vн-генів з певним Сн-геном. Такі генні перебудови і лежать в основі синтезу важких ланцюгів імуноглобулінів під час диференціювання ембріональних лімфоцитів (А. Я. Николаев, 1998).

Таким чином, завдяки можливостям утворення різних сполучень трьох генів сімейств VL, JL та CL при синтезі легких ланцюгів та чотирьох генів сімейств VH, D, JH, та Сн при синтезі важких ланцюгів, в імунній системі формуються клони лімфоцитів з різноманітною бібліотекою генів, які забезпечують експресію величезної кількості імуноглобулінів (до 107-108) з різною антигенною специфічністю та функціональними властивостями.

Ампліфікація генів

Ампліфікація генів – процес збільшення кількості копій відповідних генів. Молекулярною основою ампліфікації є багаторазова (“вибухоподібна”) ініціація синтезу ДНК (реплікації) в тому ж самому реплікаційному сайті. Прикладами ампліфікації генів вищих організмів є:

(1) ампліфікація генів металотіонеїну – білка, що зв’язує токсичні для організмів ссавців іони важких металів, зокрема ртуті, міді, цинку та кадмію. При надходженні в організм зазначених іонів відбувається збільшення частоти транскрипції металотіонеїнового гена в десятки разів, що є фізіологічним механізмом детоксикації важких металів;

(2) ампліфікація гена дигідрофолатредуктази – ферменту, що перетворює фолієву кислоту до її коферментних форм – дигідрофолатів, які є коферментами в синтезі пуринів та тиміну.

Ампліфікація гена дигідрофолатредуктази і збільшення в сотні разів рівня синтезу ферменту спостерігаються в умовах введення в організм онкологічних хворих препарату метотрексату. В основі антипухлинної дії метотрексату лежить інгібування активності дигідрофолатредуктази, що призводить до порушення синтезу нуклеїнових кислот у клітинах злоякісних пухлин. Результатом такого активованого синтезу ферменту внаслідок ампліфікації гена є втрата чутливості клітин-мішеней до протипухлинного лікарського засобу.

Ланцюгова полімеразна реакція

Явище ампліфікації генів набуло важливого практичного застосування в методі ланцюгової полімеразної реакції (ЛПР), що був запропонований в 1983 р. американським дослідником К. Мюллісом (К. Mullis) і набув поширення в сучасних біоме-дичних дослідженнях.

 

 

Рис. Схематичне зображення процесу ЛПР. (1) Денатурація при 94-96°C. (2) Відпал при ~65°C (3) Елонгація при 72°C. На малюнку зображені чотири цикли реакції.

 

Метод ЛПР дозволяє отримати в чистому вигляді і в значній кількості (достатній для проведення досліджень) певні фрагменти (послідовності) ДНК складного геному людини та ідентифікувати їх за нуклеотидним складом.

Принцип методу полягає в застосуванні РНК-праймерів, специфічних до певних ділянок ДНК, що аналізується, та подальшому використанні ДНК-полімерази, яка здатна реплікувати нуклеотидні послідовності в обох комплементарних ланцюгах, утворюючи значну кількість копій саме досліджуваного полінуклеотидного фрагмента. Ампліфіковані фрагменти ДНК виділяють з реакційного середовища і досліджують за допомогою існуючих біохімічних методів. За допомогою ЛПР здіснюється так звана “ДНК-діагностика”, що є сучасним високотехнологічним методом клінічної лабораторної діагностики багатьох небезпечних хвороб. Цей метод молекулярної діагностики, який грунтується на аналізі певних послідовностей ДНК в різних клітинах тіла людини, набув першорядного значення у виявленні спадкових хвороб, інфекційних захворювань та носійства в організмі вірусів і бактерій, що спричиняють СНІД, вірусні гепатити, туберкульоз тощо, при судово-медичній експертизі та ідентифікації особистості.

Регуляція експресії генів еукаріотів на рівні транскрипції

Гени вищих організмів мають розвинену систему сигналів регуляції транскрипції, які не лише вказують на місце початку синтезу РНК, а й регулюють його активність. До складу системи транскрипційних сигналів у еукаріотів входять:

ü промотори, специфічні для різних РНК-полімераз, але такі, що мають спільну нуклеотидну послідовність (ТАТА…), яка гомологічна блоку у прокаріотів; із цим нуклеотидним блоком взаємодіє РНК-полімераза II;

ü специфічні послідовності матричної ДНК, які підсилюють або послаблюють рівень експресії структурних генів, впливаючи на активність транскрипції, тобто на кількість молекул мРНК, що синтезуються, та швидкість їх утворення – енхансерні (підсилювальні), атенюаторні (послаблювальні), сайленсерні (заглушувальні), адапторні елементи геному.

Енхансери

Найбільш вивченими на даний час є активуючі елементи системи регуляції транскрипції – позитивні регулятори енхансери (enhancers – посилювачі, англ.). Енхансери – це ділянки ДНК, які можуть складатися з нуклеотидних послідовностей (довжиною в декілька десятків пар азотистих основ – “модулів”, або “мотивів” – motifs, англ.), що тандемно повторюються.

Енхансери збільшують ефективність транскрипції генів, на які вони впливають, в десятки і сотні разів. Встановлені нуклеотидні послідовності енхансерів для багатьох ферментних білків (хімотрипсину, алкогольдегідрогенази тощо), гормонів (інсуліну, плацентарного лактогену людини), імуноглобулінів.

Енхансери здатні впливати на активність відповідних генів навіть за умов віддаленості від їх промоторів на декілька тисяч азотистих основ. Активуюча дія енхансерів опосередкована регуляторними білками, що взаємодіють з ними і можуть впливати на транскрипцію віддалених ділянок ДНК. Разом з тим, при взаємодії з певними білковими факторами деякі енхансери можуть отримувати якості негативних регуляторів – сайленсерів (заглушувачів – англ.), що гальмують експресію відповідних генів.

Є численні регуляторні білки, що є компонентами системи транскрипційних сигналів, контролюючи активність синтезу мРНК різних класів. На даний час виділені білки, що здатні до специфічної дії з певними енхансерами. Ці білки можуть взаємодіяти з регуляторними послідовностями ДНК, що розташовані на відстані в декілька тисяч азотистих основ від сайтів взаємодії з РНК-полімеразою та ініціації транскрипції. Вважають, що такий дистантний вплив регуляторних білків реалізується за рахунок змін у просторовій конформації ланцюгів ДНК і утворення внутрішніх петель, що зближають регуляторні елементи геному з ділянками, які транскрибуються.

В адаптації організму вищих тварин до зміни умов середовища важливу участь беруть стероїдні гормони кори надниркових залоз. Встановлено, що дія цих фізіологічно активних сполук опосередкована специфічними білками-рецепторами, які в комплексі з гормонами взаємодіють з певними енхансерними ділянками геному, активуючи транскрипцію ДНК з певних генів.

Регуляція експресії генів еукаріотів на рівні трансляції

Механізмом регуляції біосинтезу білка на рівні трансляції є ковалентна модифікація білкових факторів трансляції шляхом зворотного фосфорилування-дефосфорилування за участю цАМФ-залежного регуляторного каскаду клітини.

Контроль вступу клітин до мітозу

Реплікація ДНК у еукаріотів відбувається протягом S-фази клітинного циклу, а мітоз, тобто розподіл подвоєного хромосомного матеріалу між дочірніми клітинами, починається тільки після підготовчої О2-фази. Вступу в М-фазу передує складна перебудова клітинної архітектури, що полягає в конденсації хроматину, розщепленні ядерної мембрани, реорганізації цитоскелета з формуванням мітотичного веретена тощо.

Ключовою подією в переході клітини до М-фази є активація специфічної протеїнкінази (ссіс2-білка), яка після взаємодії з білком цикліном утворює каталітично активний комплекс, що фосфорилує численні клітинні білки, необхідні для реалізації мітотичного процесу.

Послідовність біохімічних реакцій включення мітозу така:

1. Утворення комплексу кінази cdc2 з цикліном.

Сас2-кіназа – фермент з м.м. 34 кДа; назва походить від гена, що кодує цей білок -cell-division-cycle gene (ген клітинного поділу – англ.).

Циклін – білок з м.м. 45 кДа, концентрація якого поступово зростає протягом інтер-фази і різко падає в кінці мітозу.

2. Фосфорилування сс1с2-кінази, що знаходиться в комплексі з цикліном; фосфорилування відбувається за залишками Туг-15 та Thr-161 ферменту. Двічі фосфорилована кіназа є неактивною, але готовою до включення своєї каталітичної активності.

3. Дефосфорилування в молекулі ссіс2-кінази залишку Туг-15 з утворенням молекулярної форми ферменту, що фосфорильована тільки за Thr-161 і є каталітично активною.

Це дефосфорилування спричиняється специфічною протеїнфосфатазою (білком cdc25) і є пусковою реакцією у всьому каскаді біохімічних реакцій, що реалізують перехід клітини до М-фази. Активація ссіс25-фосфатази починається після завершення синтезу ДНК і відбувається протягом усього часу підготовки клітини до мітозу.

4.Каталітично активна cdc2-кіназа спричиняє фосфорилування клітинних білків,які беруть участь у запуску мітотичної фази: ламінінів ядерної мембрани, що призводять до її розщеплення; білків мікротрубочок, що формують мітотичне веретено; Н1-гістонів, фосфорилування яких веде до конденсації ядерного хроматину.

Викликає значний інтерес, що ссіс2-кіназа включає ферментативний механізм, який призводить до обмеження її власної каталітичної активності і, як наслідок, виключення мітозу.

Обмеження активності ссіс2-кінази досягається за рахунок розщеплення зв’язаного з нею цикліну. Молекулярний комплекс “циклін – монофосфорилована (за Thr-161) ссіс2-кіназа” є субстратом для взаємодії з убіквітином (ubiquitin – англ.) – низькомолекулярним (8,5 кДа) протеїном, що є універсальним лігандом для “мічення” білків, які підлягають подальшій деструкції під дією протеаз. Сполучення убіквітину з комплексом “циклін-ссіс2-кіназа” призводить до обмеженого протеолізу цикліну і припинення клітинних реакцій, що реалізують процес мітозу.

Генна інженерія. Рекомбінантні ДНК

Рекомбінації генів, що були розглянуті вище, є природним процесом, який реалізується in vivo і є біологічним механізмом, спрямованим на збільшення різноманітності генетичного матеріалу в клітинах різних організмів.

Генна інженерія, або технологія рекомбінантних ДНК – науково-практичний напрямок сучасної біомедичної науки, основою методології якого є виділення з клітин індивідуальної ДНК та направлене маніпулювання з її молекулами, зокрема отримання молекулярних химер, тобто молекул, сформованих із фрагментів ДНК різних біологічних видів.

Біомедичне значення методів генної інженерії

Біотехнологічні методи генної інженерії мають на меті:

1) отримання нових генотипів (та фенотипів) організмів шляхом трансплантації гена одного організму в генотип іншого. Конкретними досягненнями цього біотехнологічного напрямку є створення химерних форм мікроорганізмів, що містять в собі гени, спроможні спрямовувати синтез корисних для людини білкових продуктів, зокрема лікарських засобів (інтерферонів, гормонів – інсуліну тощо), ферментів, імунобіологічних препаратів (зокрема, вакцини проти вірусу гепатиту В) тощо;

2) застосування “генних трансплантацій” для лікування спадкових хвороб людини та тварин – генна терапія. Цей напрямок біотехнологічних досліджень знаходиться на початку свого розвитку і обіцяє в майбутньому створити принципово нові медичні технології терапії практично невиліковних у наш час спадкових хвороб та значної кількості найбільш поширених хвороб, у патогенезі яких певне місце займають спадкові фактори (атеросклероз, цукровий діабет, нервово-психічні хвороби тощо). Такий підхід був уже реалізований у терапії спадкового гіпогонадизму у мишей, в запліднену яйцеклітину яких був імплантований ген гонадоліберину.

Технологія трансплантації генів:

  1. отримання в чистому вигляді, тобто у формі ізольованого фрагмента ДНК, гена з певними властивостями (тобто такого, що кодує синтез необхідного ферменту, гормону тощо);
  2. конструювання рекомбінантної (гібридної, химерної) молекули ДНК;
  3. введення рекомбінантної ДНК всередину реципієнтної бактеріальної клітини (тобто такої, в якій буде здійснюватися реплікація, клонування необхідного гена);
  4. клонування рекомбінантної ДНК.

1. Отримання необхідного гена

Отримання гена (молекули ДНК), що буде підлягати реплікації (клонуванню) з виходом значної кількості реплікантів, може бути здійснено такими методами:

  • Ø хімічним синтезом гена (можливо тільки для коротких генів, що складаються з декількох десятків азотистих основ);
  • Ø виділенням необхідного гена (фрагмента ДНК) з цілісного геному клітини (проблема утруднена у зв’язку із значною складністю геномів еукаріотів, у складі яких значна кількість інтронів та повторів, які не транскрибуються);
  • Ø конструюванням на мРНК (що кодує синтез білка, який бажано отримати в результаті біотехнологічної процедури) комплементарної відносно неї ДНК (кДНК). Цей метод потребує застосування зворотної транскриптази– ферменту, що присутній у деяких РНК-вмісних вірусах і забезпечує синтез ДНК на РНК матриці.

Метод широко використовується для отримання кДНК і включає в себе виділення з тотальної мРНК тканини мРНК, що кодує трансляцію певного білка (наприклад, інтерферону, інсуліну) з подальшим синтезом на цій мРНК як на матриці необхідної кДНК за допомогою зворотної транскриптази.

2. Конструювання рекомбінантної ДНК

Ген, що був отриманий за допомогою вищерозглянутої процедури (кДНК), необхідно ввести в бактеріальну клітину таким чином, щоб він інтегрувався в її геном. Для цього формують рекомбінантну ДНК, що складається з кДНК та особливої молекули ДНК, яка править за провідник, або вектор, здатний до проникнення в реципієнтну клітину.

У ролі векторів для кДНК застосовують віруси або плазміди. Плазміди – це невеличкі кільцеві молекули ДНК, які розташовані окремо від нуклеоїду бактеріальної клітини (зокрема, Е. соlі), містять у своєму складі декілька важливих для функції всієї клітини генів (наприклад, гени стійкості до антибіотиків) і можуть реплікуватися незалежно від основного геному (ДНК) клітини. Біологічно важливими і практично корисними для генної інженерії властивостями плазмід є їх здатність до переходу з однієї клітини в іншу за механізмом трансформації або кон’югації, а також спроможність включатися в бактеріальну хромосому та реплікуватися разом з нею.

Для конструювання рекомбінантної ДНК як кільцеву ДНК плазміди, так і лінійну кДНК розщеплюють за допомогою високоспецифічних до певних нуклеотидних послідовностей ендонуклеаз – так званих рестриктаз.

Рестриктази (рестрикційні ендонуклеази) – ферменти, присутність яких в бактеріальній клітині “обмежує” (restriction – обмеження, англ.) можливість розмноження в них певних бактеріофагів за рахунок розщеплення рестриктазами фагових ДНК. Назви рестриктаз грунтуються на назвах штамів бактерій, з яких їх виділяють: наприклад, рестриктази Eco RI та Eco RII походять з R-штаму Е. соlі, рестриктаза Ват НІ – зі Н-штаму мікроорганізму Bacillus amiloliquefaciens.

Рестриктази (яких на даний час відомо більше 200 типів) розщеплюють дволанцюгову ДНК лише в ділянках певних нуклеотидних послідовностей (зазвичай довжиною в 4-7 азотистих основ, які мають структуру паліндромів), що дозволяє використовувати ці ендонуклеази для “розрізання” молекул ДНК в суворо визначених сайтах. Наприклад, рестриктаза Eco RI гідролізує зв’язки між G та А в таких послідовностях:

…GAATTC… …CTTAAG…

Розщеплення рестриктазою G-A зв’язків у зазначених сайтах дволанцюгової ДНК супроводжується утворенням в молекулі “кінців, що стирчать”. Одноланцюгові кінці молекули ДНК, що “стирчать”, називають також “липкими” кінцями, оскільки вони є ділянками неспарених нуклеотидів, що можуть легко сполучатися з комплементарними їм полінуклеотидними ланцюгами.

Розщеплення ДНК плазміди та кДНК (гена) специфічними рестриктазами призводить до утворення розрізаних в певних сайтах молекул ДНК з “липкими” кінцями. При взаємодії in vitro “розрізаних” плазміди та гена їх полінуклеотидні ланцюги, що складають “липкі” кінці, взаємодіють із утворенням водневих зв’язків між комплементарними основами. Застосування ДНК-лігази, яка утворює 3′-5′-фосфодіефірні зв’язки між кінцевими нуклеотидами, призводить до “зшивання” плазміди та гена і завершує утворення рекомбінантної ДНК.

3. Введення рекомбінантної ДНК всередину реципієнтної клітини та клонування необхідного гена

Рекомбінантні ДНК, що складаються з плазмідної ДНК та ДНК гена, що трансплантується (наприклад, гена, який кодує синтез певного білка організму людини) при взаємодії з бактеріальними клітинами (що є нормальними хазяїнами для даної плазміди), можуть проникати всередину останніх.

Усередині клітини хазяїна відбувається реплікація (клонування) рекомбінантної ДНК з утворенням багатьох тисяч копій. У подальшому ці клоновані ДНК виходять з бактеріальної клітини, і з них можливо (знову ж таки за допомогою рестриктаз) виділити велику кількість копій шуканого гена.

Нині для клонування генів, крім бактерій, використовують клітини дріжджів, грибів, рослин і навіть вищих тварин. За розглянутою технологією здійснено генно-інженерний синтез інтерферону людини, людських інсуліну, гормону росту, соматостатину, активатора плазміногену, білкових препаратів для діагностики СНІДу тощо.

 

МУТАЦІЇ – зміни спадкових властивостей внаслідок кількісних та якісних змін у генотипі організму. В процесі реплікації ДНК мутації передаються від клітини до клітини і від покоління до покоління.

Разом з генетичними рекомбінаціями, мутації складають основу спадкової мінливості живих організмів. Мутації можуть бути спричиненими певними природними – спонтанні мутації або штучними факторами – індуковані мутації.

За характером змін у структурі генетичного апарату організму мутації поділяють на:

  • Ø геномні мутації – такі, що полягають у змінах кількості повного набору хромосом або окремих хромосом у диплоїдному наборі; такі мутації спричиняють найбільш поширені та важкі форми хромосомних хвороб людини;
  • Ø хромосомні мутації – мутації, що пов’язані із структурними змінами певних хромосом (хромосомні аберації) внаслідок переміщення, втрати або дуплікації окремих фрагментів хромосомної ДНК. Розрізняють такі типи хромосомних мутацій:

ü транспозиції – перенесення фрагмента ДНК в іншу ділянку тієї ж хромосоми;

ü транслокації – перенесення ділянки однієї хромосоми на іншу, негомологічну їй, хромосому;

ü інверсії – зміна в певній ділянці хромосоми послідовності генів (азотистих основ) на іншу, зворотну послідовність;

ü делеції – випадіння певних ділянок хромосоми (фрагментів ДНК);

ü дуплікації – подвоєння певних ділянок хромосом.

  • Ø генні (точкові) мутації – зміни в структурі геному, що полягають в порушеннях послідовності азотистих основ (нуклеотидів), які складають первиннуструктуру ДНК. Генні мутації поділяють на такі типи:

v заміни нуклеотидів – найбільш поширені генні мутації, до яких належать такі субтипи, як:

–       транзиції – заміна однієї пуринової основи на пуринову або піримідинової на піримідинову;

–       трансверзії – заміна одного типу азотистих основ на інший, тобто пурину на піримідин або навпаки;

v випадіння (делеції) в ланцюгу ДНК однієї або декількох азотистих основ (і відповідних нуклеотидів);

v вставки (вбудовування) в ланцюг ДНК додаткових азотистих основ (однієї або більшої кількості).

Генні мутації, якщо вони не репаровані спеціальними ферментними системами клітини, призводять до припинення синтезу білка, що кодується відповідним геном, або до утворення білка зі зміненою, “неправильною” первинною структурою.

Агенти, що спричиняють мутації (мутагени)

Мутації (найчастіше генні мутації) виникають внаслідок пошкоджень, спричинених несприятливою дією на геном хімічних, фізичних та біологічних факторів навколишнього середовища, або похибок у функціонуванні ДНК-полімераз на етапі реплікації ДНК.

Найбільш поширеними мутагенами є:

(1) аналоги азотистих основ – сполуки, що заміщують нормальні азотисті основи в полідезоксирибонуклеотидному ланцюгу. Найбільш поширеними речовинами цього класу є 5-бромурацил та 2-амінопурин;

(2) хімічні мутагени – сполуки, що призводять до змін ковалентної структури нормальних азотистих основ; до найпоширеніших хімічних мутагенів належать:

а) дезамінуючі агенти – азотиста кислота (HNО2) та речовини, що в процесі метаболізму можуть перетворюватися на нітрити, зокрема органічні сполуки – нітрозаміни. Під дією азотистої кислоти відбувається дезамінування цитозину (з утворенням урацилу), аденіну і гуаніну (з утворенням гіпоксантину та ксантину, відповідно). Заміна одного нуклеотиду в ланцюгу ДНК супроводжується зміною змісту певного кодону (місенс-мутація) та синтезу білка із зміненою амінокислотною послідовністю. Вважають, що за рахунок мутації такого типу виникли аномальні форми гемоглобінів зі зміненою первинною структурою в β-ланцюгах;

б) алкілюючі агенти – сполуки, що призводять до метилювання (в загальному випадку – алкілювання) звичайних азотистих основ. До алкілюючих агентів належать: алкілсульфонати (диметилсульфонат, етилметансульфонат тощо), азотисті та сірчанисті біс-хлоретиламіни (іприти), алкілнітрозаміни тощо; багато з цих сполук мають протипухлинну (антибластомну) активність і застосовуються в клінічній та експериментальній онкології.

(3) ультрафіолетове (УФ-) та іонізуюче опромінення – фізичні фактори, висока мутагенна активність яких пояснюється вільнорадикальною деструкцією азотистих основ ДНК з утворенням їх аналогів із зміненою хімічною будовою.

 

Рис. Головний мутаген тютюнового диму – бензпірен – зв’язаний з одним із нуклеотидів молекули ДНК

 

Поширеною мутацією, що спостерігається при дії УФ-випромінення є утворення ковалентних зв’язків між сусідніми (розташованими в одному ланцюгу) залишками тиміну. Такі тимінові димери протидіють нормальному просуванню ДНК-полімераз в ході реплікації. Синтез ДНК припиняється.

Механізми репарації ДНК

Усі живі організми на Землі підлягають постійній дії фізичних мутагенних факторів, зокрема опроміненню УФ-променями (з довжиною хвилі 200-400 нм), що складають значну частину сонячного спектра, та іонізуючою радіацією, джерелом якої є космічне випромінення та радіоактивні ізотопи радію, плутонію, вуглецю тощо, що містяться в неорганічних об’єктах навколишнього середовища. За оцінками фахівців, вплив УФ- та іонізуючого опромінення є відповідальним за приблизно 10% усіх пошкоджень ДНК, що спричиняються небіологічними факторами. Наступним важливим компонентом мутагенного впливу навколишнього середовища на геном живих організмів є дія численних хімічних сполук, зокрема речовин чужорідного походження – ксенобіотиків, які постійно впливають на ядерну генетичну ДНК. Як і в разі дії розглянутих фізичних чинників, механізм ушкоджуючої дії хімічних мутагенів значною мірою залежить від утворення в клітині вільних радикалів кисню та води, що спричиняють зміни в ковалентній структурі азотистих основ ДНК (Ю.І.Губский, 1993).

Вплив на геном живих організмів розглянутих фізичних та хімічних чинників супроводжується нестабільністю ДНК, що зазнає постійних точкових мутацій, найчастішими з яких є відщеплення пуринових основ (депуринізація ДНК), дезамінування цитозину та депіримідинізація. У зв’язку із зазначеним, в еволюції живих організмів виникли спеціальні молекулярні механізми, що протидіють постійним ушкодженням молекул ДНК та репарують зміни в молекулярній будові ДНК, що вже відбулися.

  1. Репарація пошкоджень, спричинених УФ-опраміненням.

Пошкодження ДНК, спричинені УФ-променями, найбільш часто спостерігаються в бактеріальних клітинах та в незахищеній від сонячного опромінення шкірі людини. Відновлення нормальної структури ДНК, порушеної утворенням димерів тиміну, реалізується шляхом дії певних механізмів (етапи I-IV):

  1. Розщеплення (“розрізання”) ланцюга ДНК “зліва” (в напрямку –3’→5′) від димера і відведення вбік вільного кінця, що містить тиміновий димер; реакція каталізується особливим ферментом – УФ-специфічною ендонуклеазою.
  2. Формування полідезоксирибонуклеотидної “латки” на фрагмент ділянки ДНК, що містить димер; реакція каталізується ДНК-полімеразою (у прокаріотів – ДНК-полімеразою І) і полягає в приєднанні мононуклеотидів до вільного 3′-кінця “розрізаного” ланцюга ДНК в напрямку 5’→3′.

ІІІ. Відщеплення пошкодженої (такої, що містить тиміновий димер) ділянки ДНК (у прокаріотів – за рахунок 5’→3′ екзонуклеазної активності ДНК-полімерази І).

ІV. “Зшивання” 3′-кінця ново синтезованої “латки” з 5′-кінцем розрізаного основного ланцюга ДНК.

Порушення ферментативного процесу репарації УФ-індукованих пошкоджень ДНК призводить у людини до важкого спадкового захворювання – пігментної ксеродерми. Пігментна ксеродерма успадковується як автономно-рецесивна хвороба; при цій патології шкіра пацієнтів є надзвичайно чутливою до пошкоджуючої дії сонячного світла, яке може спричиняти розвиток раку шкіри. Найбільш поширена форма пігментної ксеродерми зумовлена спадковим порушенням синтезу УФ-специфічної ендонуклеази, що призводить до порушення всього механізму репарації ДНК.

  1. Репарація дезамінування цитозину.

Дезамінування цитозину (2-окси-4-амінопіримідину) призводить до утворення урацилу (2,4-діоксипіримідину) – реакція, що спонтанно проходить у водних розчинах цитозину. В результаті цього процесу (заміни С на U) в комплементарному ланцюгу ДНК при реплікації також відбувається заміна відповідної пуринової основи (замість гуаніну включається аденін). У кінцевому підсумку дочірня дволанцюгова ДНК в тому положенні, де повинна була би бути пара G-C буде містити пару А-Т, тобто відбудеться мутація типу заміни. Репарація такої мутації включає в себе:

а) видалення з ланцюга ДНК “неправильної” основи за рахунок відщеплення урацилу урацил-ДНК-глікозидазою. Фермент гідролітичним шляхом розриває N-глікозидний зв’язок між азотистою основою (урацилом) та дезоксирибозою, утворюючи пентозофосфатний ланцюг без азотистої основи. За аналогічним механізмом діють і інші ДНК-глікозидази, що формує апіримідинові та апуринові ділянки в пошкодженій молекулі ДНК;

б) розщеплення ендонуклеазою 3′,5′-фосфодіефірного зв’язку “зліва” від депіримідинізованого пентозофосфатного залишку;

в) вбудова “правильної” азотистої основи (в даному випадку – цитозину) на місце видаленої основи за рахунок дії ДНК-полімерази;

г) зшивання розриву в ланцюгу ДНК-лігазою.

Матеріали для самоконтролю:

  1. У біотехнологічних методах генної інженерії для отримання нових речовин використовують плазміди. В яких біохімічних процесах їх використовують?

А. Перенесенні генетичної інформації;       В. Біосинтезу ензимів;  С. Біосинтезу ліпідів;  D. Біосинтезу гормонів;   Е. Біосинтезу білка.

  1. Надлишок УФ-світла негативно впливає на живі організми. Під дією сонячного опромінення в ДНК шкіри людини найчастіше утворюються:

А. Хромосомні мутації;     В. Делеції;      С. Заміни нуклеотидів;     D. Одноланцюгові ДНК;        Е. Тимінові димери.

  1. Онкогенні віруси для перенесення своєї інформації із РНК на ДНК використовують зворотню транскрипцію. Вкажіть за допомогою якого фермента утворюється гібридна РНК-ДНК.

А. Транскриптаза;          В. РНК-полімераза;           С. Рибонуклеаза;

D. Ревертаза;           Е. ДНК-синтетаза.

  1. У хворих на пігментну ксеродерму шкіра надзвичайно чутлива до сонячного світла, може розвитись рак шкіри. Причиною є спадкова недостатність ферменту УФ-ендонуклеази. Внаслідок цього дефект порушується процес:

А. Транскрипції;          В. Трансляції;        С. Зворотної транскрипції;

D. Реплікації ДНК;               Е. Репарації ДНК.

  1. У клітині відбулася мутація першого екзону структурного гена. В ньому зменшилася кількість пар нуклеотидів – замість 290 пар стало 250. Визначте тип мутації:

А. Делеція;            В. Нонсенс-мутація;                С. Транслокація;

D. Інверсія;             Е. Дуплікація.

  1. Молекулярний аналіз гемоглобіну пацієнта з анемією виявив заміну 6-Глу на 6-Вал у бета-ланцюгу. Який молекулярний механізм патології?

А. Генна мутація;     В. Геномна мутація;     С. Трансдукція генів;    D. Хромосомна мутація;        Е. Ампліфікація генів.

  1. Розвиток методів виділення генів і з’єднання їх у нових комбінаціях стало новим біохімічним досягненням генетичних досліджень. Для з’єднання ланцюгів ДНК, що виділені із різних організмів застосовують:

А. Реструкційну ендонуклеазу;     В. Ліазу;      С. Синтетазу;           D. Трансферазу;                    Е. Геліказу.

  1. РНК вірусу СНІДу, проникла всередину лейкоцита і за допомогою фермента ревертази спричинила синтез у клітині вірусної ДНК. В основі цього процессу лежить:

А. Зворотня транскрипція; В. Депресія оперону; С. Репресія оперону;   D. Зворотня трансляція;    Е. Конваривантна реплікація.

  1. Генний апарат людини містить близько 30 тис. генів, а кількість варіантів антитіл сягає мільйонів. Який механізм використовується для утворення нових генів, що відповідають за синтез такої кількості антитіл?

А. Ампліфікація генів;        В. Утворення фрагментів Оказакі;         С. Рекомбінація генів;    D. Реплікація ДНК;     Е. Репарація ДНК.

  1. Нітрозаміни належать до дезамінуючих мутагенів. Із якої азотистої основи в результаті їх дії утворюється урацил?

А. Тиміну;  В. Метилурацилу;  С. Аденіну; D. Гуаніну; Е. Цитозину.

 

Рекомендована література:

  1. Губський Ю.І. Біологічна хімія, 2007. – С.372 – 395.
  2. Гонський Я.І., Максимчук Т.П. Біохімія людини, 2001. –С.490-506.
  3. Бышевский А.Ш., Терсенов О.А. Биохимия для врача, 1994. – С.222-246.
  4. МещишенІ.Ф., ЯремійІ.М. Клініко-біохімічні ситуаційні задачі. – Чернівці: Медик, 2005.-84с.
  5. Champe P.C., Harvey R.A. Lippincontt’s illustrated reviews: biochemistry. – London, New York: J.B.Lippincott company, 1994. – 445 p.
  6. Marks Dawn B. Biochemistry. – Pennsylvania:Harval publishing, 2004.- 338p.
  7. Murray R.K, Granner D.K., Rodwell V.W. Harper’s illustrated biochemistry.- The McGraw-Hill Companies, Inc., 2006.- 692 p.
ЗАВАНТАЖИТИ

Для скачування файлів необхідно або Зареєструватись

РЕГУЛЯЦІЯ ЕКСПРЕСІЇ ГЕНІВ ГЕННІ МУТАЦІЇ (174.1 KiB, Завантажень: 1)

завантаження...
WordPress: 23.01MB | MySQL:26 | 0,349sec