ПЕРОКСИДНЕ ОКИСНЕННЯ ЛІПІДІВ ТА БІОПОЛІМЕРІВ. АНТИОКСИДАНТИ

Методичні вказівки для самостійної

позааудиторної роботи студентів з теми №18:

“ПЕРОКСИДНЕ ОКИСНЕННЯ ЛІПІДІВ ТА БІОПОЛІМЕРІВ. АНТИОКСИДАНТИ

Актуальність теми: Активні форми кисню в організмі людини активують процеси пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ), які є причиною майже всіх патологічних станів. Розуміння процесів ПОЛ і механізмів дії основних природніх та штучних антиоксидантів дозволить вміти запропонувати пацієнту адекватну антиоксидантну терапію при тій чи іншій патології.

Тривалість заняття: 6 годин.

Навчальна мета:

Знати: основні реакції утворення активних форм кисню, механізм реакцій пероксидного окиснення ліпідів, основні етапи антиоксидантного захисту.

Вміти: оцінити стан оксидантних процесів в організмі пацієнта за даними лабораторних досліджень.

Засвоїти практичні навички: розвязок клініко-ситуаційних завдань.

 

 

 

Базові знання

Дисципліна Отримані навички
Неорганічна хімія Окиснювально-відновні реакції

 

Контрольні питання

  1. Утворення в організмі активних форм кисню, їх біологічна роль.
  2. Механізм пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ) клітинних мембран. Окиснювальний стрес.
  3. Антиоксидантні системи організму людини.
  4. Порушення співвідношення активності оксидантних і антиоксидантних систем організму – основа патологічного процесу.

 

Конспект теми:

Активні форми кисню (АФК)– синглетний кисень, пероксид водню, супероксидний аніон-радикал, гідроксильний радикал.

Надлишок АФК у організмі виникає при дії радіації, стресі, інтоксикації, запальних процесах, алергічних реакціях, надлишку іонів металів із змінною валентністю та полієнових жирних кислот, гіпербарична оксигенація, недостатність власних систем антиоксидантного захисту. Надлишок АФК у організмі призводить до посилення процесів пероксидного окиснення ліпідів, окиснювальної модифікації білків та біополімерів.

Донорами електронів для утворення активних форм кисню можуть бути: 1) електронтранспортні ланцюги мітохондріального та мікросомального окиснення при переключенні використання кисню з оксидазного на оксигеназний шлях; 2) окиснення гемоглобіну в метгемоглобін; 3) оксидазні та оксигеназні реакції завершуються утворенням пероксиду водню, наприклад, ксантиноксидазна, розпад катехоламінів, мікросомальне окиснення етилового спирту тощо; 4) іони металів із змінною валентністю (Fe, Cu, Mn, Mo, Cr). Останні сприяють трансформації одних активних форм кисню в інші:

На відміну від молекули O2 в основному стані синглетний кисень має високу хімічну активність. Типовим для ′O2 є реакції взаємодії з подвійним зв’язком, які протікають з утворенням діоксиетанів, які можуть переходити у гідропероксиди:

 

 

Одноелектронне відновлення О2 приводить до утворення супероксидного аніон-радикалу (О2•–) або його протонованої форми – гідропероксидного радикалу (НО2). Супероксид утворюється у всіх аеробних клітинах і є родоначальником інших активних форм кисню. Утворення О2•–  проходить найчастіше у ланцюгах перенесення електронів – дихальному і мікросомальному – в результаті “втечі” електронів від проміжних компонентів ланцюга на кисень. Утворення О2•– може проходити на двох ділянках мікросомального ланцюга – на цитохромі Р-450 і на НАДФН-цитохром-Р-450-оксидоредуктазі. У мітохондріальному дихальному ланцюгу ділянкою генерації О2•– є флавопротеїн.

Супероксидний аніон-радикал має слабко виражені відновлювальні властивості й одночасно може окиснювати деякі сполуки (наприклад, адреналін і аскорбінову кислоту). При протонуванні (приєднанні Н+) O2‾ утворюється НO2, який є більш сильним окиснювачем, ніж O2‾, і може безпосередньо реагувати з лінолевою, ліноленовою та арахідоновою кислотами з утворенням гідропероксидів. Крім реакцій з різними біомолекулами O2‾ вступає в реакцію дисмутації за участі супероксиддисмутази (СОД):

 

О2•– + О2•– + 2Н+ → Н2О2 + О2

 

СОД у комбінації з ферментами каталазою і глутатіонпероксидазою є основною ферментативною захисною системою клітини від шкідливої дії O2‾ та інших активних форм кисню.

Утворення в клітинах пероксиду водню може проходити за рахунок взаємодії іону і радикалу гідроксилу з киснем:

,

а також при двохелектронному відновленні кисню:

 

В організмі людини утворення Н2О2 спостерігається при активації фагоцитуючих клітин та роботі мітохондрій і мікросом. Як стабільний продукт відновлення кисню, Н2О2 має властивості слабкого окиснювача, які проявляються, зокрема, в присутності іонів змінної валентності (феруму, купруму тощо). При цьому утворюється високоактивний НО-радикал і іон гідроксилу:

 

Далі реакції протікають через ряд стадій:

 

 

Для пригнічення утворення гідроксильних радикалів у результаті одноелектронного відновлення Н2О2 у кожній клітині існують ферменти каталаза і пероксидази, в яких проходить двохелектронне відновлення Н2О2 до Н2О без виділення в навколишнє середовище проміжних вільнорадикальних продуктів.

Вільні радикали – це частинки (атоми чи молекули), які мають на зовнішній оболонці один або декілька неспарених електронів. Одноелектронне відновлення Н2О2 призводить до утворення гідроксильних радикалів, які мають високу реакційну здатність. Розклад Н2О2 в присутності іонів металів змінної валентності є основним шляхом утворення гідроксильних радикалів.

Для .ОН-радикалів характерні три основні типи реакцій:

1. Відрив атому водню від органічної молекули:

 

2. Приєднання до молекули по місцю подвійного зв’язку:

 

3. Перенесення електрона:

 

Іони металів зі змінною валентністю, особливо іони феруму, відіграють певну роль у взаємному перетворенні активних форм кисню, зокрема в утворенні найбільш руйнівного із них – .ОН-радикала, розпад Н2О2 з утворенням НО-радикалів, беручи таким чином участь в окисненні різних субстратів пероксидом водню. Низькомолекулярні комплекси заліза теж розкладають Н2О2 з утворенням НО-радикалів.

 

Пероксидне окиснення ліпідів (ПОЛ) – це процес, який зв’язаний з активацією кисню. Молекула кисню може активуватися вільними радикалами:

 

Утворюється пероксидний радикал органічної сполуки, який взаємодіє з новою молекулою органічної сполуки, в результаті чого виникає процес ланцюгового (пероксидного) окиснення речовин, і, зокрема, поліненасичених жирних кислот, які входять до складу фосфоліпідів біологічних мембран і ліпопротеїнів плазми крові:

 

 

Схема ланцюгових реакцій пероксидного окиснення ліпідів:

 

 

Пероксидне окиснення лінолевої кислоти:

 

 

Окиснювальна модифікація білків

Процес окиснювальної модифікації (хімічної зміни структури) білка, як і процес пероксидного окиснення ліпідів, протікає за вільнорадикальним механізмом. На відміну від пероксидного окиснення ліпідів, окиснювальна модифікація білків при окиснювальному стресі має специфічний характер. При вільнорадикальній патології перш за все відбувається окиснення ліпідів, інтенсивність якого залежить від стану антиоксидантного захисту органів і тканин. У результаті пероксидації ліпідів утворюється велика група сполук, що проявляють гено- і цитотоксичну дію. Білки окиснюються на другому етапі, й у цей процес включаються не лише АФК, але й інші радикали, зокрема органічні радикали ПОЛ. На завершальних стадіях окиснювального стресу, коли спостерігається виснаження антиоксидантного захисту органів і тканин, відбувається більш виражене окиснювальне руйнування білків. Внаслідок особливостей хімічної будови білків, їх функціональної активності, окиснювальна деструкція може бути однією з патогенетичних ланок багатьох (якщо не всіх) захворювань, які відбуваються на фоні окиснювального стресу.

Механізм окиснювальної деградації білків:

Активні форми кисню викликають зміни первинної, вторинної і третинної структури білків. Окиснювальним перетворенням піддаються всі амінокислотні залишки білків. Особливо чутливими до АФК є залишки Гіс, Ліз, Арг, Сер, Тре. Внаслідок окиснювальної модифікації активних центрів білків-ферментів останні можуть втрачати свою активність. Так, супероксидний аніон-радикал гальмує in vitro активність каталази, глутатіонпероксидази тощо. Пероксид водню викликає інактивацію супероксиддисмутази, а гідроксильний радикал гальмує активність глутатіонпероксидази, РНК-ази тощо.

Гальмування активності ферментів під впливом АФК пов’язане з локальними порушеннями структури в ділянці активного центру окиснювальною модифікацією амінокислотних залишків, що входять до його складу і/або зміною валентності металу для ряду металовмісних ферментів. Окисненим білкам притаманна підвищена чутливість до протеолізу й фактично в організмі протеолітичного розщеплення зазнають окиснені білки, а не нативні. Разом з тим, в результаті внутрішньо- і міжбілкових взаємодій окремих угруповань окиснених білків утворюються комплекси, стійкі до протеолізу, які здатні гальмувати протеолітичну активність ферментів, що розщеплюють інші окиснені білки. Ці білкові агрегати накопичуються в тканинах у процесі старіння та при різноманітних захворюваннях.

 

СИСТЕМИ АНТИОКСИДАНТНОГО ЗАХИСТУ

Речовини, які активують пероксидне окиснення ліпідів, називають прооксидантами, а ті, які обривають (гальмують) цей процес – антиоксидантами. До прооксидантів належать сполуки, які легко самоокиснюються й утворюють вільні радикали (вітаміни D, К), відновники (НАДФН, ліпоєва кислота), вільнорадикальні метаболіти, які виникають при дії інших прооксидантів.

Антиоксиданти в організмі людини утворюють складну багатокомпонентну антиоксидантну систему, яка забезпечує зв’язування і модифікацію вільних радикалів, гальмує утворення або розкладає пероксиди. До її складу входять гідрофільні (глутатіон, аскорбінова кислота) і гідрофобні (вітаміни А, Е, флавоноїди, убіхінони) органічні речовини з відновлювальними властивостями, а також ферменти, які підтримують гомеостаз цих речовин і антипероксидні ферменти (супероксиддисмутаза, каталаза, пероксидази).

Основним антиоксидантним ферментом є супероксиддисмутаза (СОД). СОД складається із двох субодиниць, включає 1 атом феруму і 1 атом цинку (Cu,Zn-СОД) і каталізує дисмутацію супероксидних аніон-радикалів.

Супероксидний аніон-радикал у плазмі крові руйнується за допомогою церулоплазміну (купрумвмісний глікопротеїн α-2-глобулінової фракції білків сироватки крові). Характерно, що при знешкодженні супероксидного аніон-радикалу за допомогою церулоплазміну, на відміну від супероксиддисмутазної реакції, не утворюється пероксид водню.

Другою ланкою захисту організму від активних форм кисню є ферменти, які розкладають пероксид водню: каталаза і пероксидаза. Найважливішою пероксидазою є селензалежна глутатіонпероксидаза, яка діє не лише на пероксид водню, але й на інші гідропероксиди, зокрема на гідропероксиди жирних та нуклеїнових кислот.

Деякі низькомолекулярні сполуки легко взаємодіють з НО-радикалами та іншими активними формами кисню. Ці сполуки можуть перехоплювати радикали і, цим самим, виконують захисну функцію. До цих сполук, які містяться у кожній клітині, належать, насамперед, аскорбінова кислота, відновлений глутатіон і сечова кислота.

Глутатіон є хорошим акцептором НО-радикалів і синглетного кисню. Крім безпосередньої взаємодії з радикалами кисню глутатіон є косубстратом глутатіонпероксидази і глутатіонредуктази і, таким чином, може брати участь у вилученні Н2О2 із клітини.

 

Сечова кислота є ефективним акцептором синглетного кисню і НО-радикалів. Крім аскорбінової кислоти, відновленого глутатіону і сечової кислоти, взаємодіяти з НО-радикалами, синглетним киснем можуть і деякі інші сполуки, які знаходяться в організмі людини, – глюкоза, маніт,етанол. Ці сполуки проявляють захисну дію при окиснювальних процесах, викликаних активними формами кисню. Відома також антиоксидантна дія білірубіну (продукт катаболізму гема).

 

 

 

Використання антиоксидантів у медицині.

Антиоксиданти можна поділити на такі класи:

1. Антиоксиданти прямої дії: а) жиророзчинні антиоксиданти – токоферолу ацетат, убіхінони, дибунол (іонол), аевіт, екстракт елеутерококу; б) водорозчинні антиоксиданти – аскорбінова кислота, рутин, кверцетин, флакумін; в) тіолові антиоксиданти – відновлений глутатіон, ліпамід, цистеамін.

2. Антиоксиданти непрямої дії: а) попередники глутатіону – глутамінова кислота, цистеїн, метіонін; б) попередники піридиннуклеотидів – препарат нікотинової кислоти – компламін; в) індуктори пероксидаз – натрію селеніт.

Вітамін Е проявляє різноманітну дію. Як активний елемент ендогенної антиокиснювальної системи, токоферол “гасить” синглетний кисень і цим самим запобігає пероксидному окисненню ненасичених жирних кислот ліпідів мембран. Цей механізм захисту клітинних мембран від активних форм кисню особливо важливий для клітинних структур, які позбавлені ферментативної системи захисту (супероксиддисмутаза), наприклад, для мембран ендоплазматичного ретикулуму гепатоцитів. Крім того, вітамін Е бере участь у стабілізації клітинних мембран і, цим самим, обмежує проникнення активних форм кисню у гідрофобний шар мембрани.

Крім токоферолів, синглетний кисень “гасять” і каротиноїди. Природні антиоксиданти в організмі людини існують у двох формах: окисненій (хінонній) і відновленій (фенольній). Тільки відновлені форми, які містять вільну гідроксильну групу, активно реагують з пероксидними радикалами і мають високу антирадикальну активність. Речовини, які здатні відновлювати хінонні форми природних антиоксидантів, регенеруючи їх антирадикальну активність, є синергістами. Роль синергістів виконують речовини, які легко переходять із окисненої форми у відновлену, наприклад, аскорбінова і лимонна кислоти, деякі сірковмісні сполуки.

Первинним механізмом захисної дії антиоксидантів є взаємодія їх з продуктами й ініціаторами пероксидного окиснення ліпідів, а саме з радикалами (R•, ROO•), з активними формами кисню, з гідропероксидами жирних кислот, а також з каталізаторами пероксидного окиснення, насамперед з іонами металів змінної валентності. В організмі людини існує ряд комплексоутворювальних і хелатуючих агентів, які здатні зв’язувати іони металів змінної валентності, а звідси – проявляти антиоксидантну дію. До них належать: лимонна і аскорбінова кислоти, гліцин, цистеїн тощо. Аскорбінова кислота відіграє головну роль в стабілізації НS-груп тіолових ферментів, затримці передчасного окиснення катехоламінів і циклічних амінокислот, а також у процесах знешкодження лікарських речовин і отрут.

Ряд вітамінів – пантотенова і ліпоєва кислоти, тіамін, рибофлавін, не проявляючи антиоксидантної активності, беруть участь у функціонуванні гідроксилюючої системи, яка відіграє роль у стабілізації мембранних фосфоліпідів.

Флавоноїд силімарин як “пастка” для вільних радикалів, пригнічує перекисне окиснення ліпідів в мікросомах і мітохондріях печінки з такою ж активністю, як і кверцетин.

Серед синтетичних антиоксидантів найбільш вивчений у клініці іонол (2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол), який випускається під назвою дибунол. Він використовується при лікуванні раку сечового міхура, променевих циститів, раку прямої кишки, виразок гастродуоденальної зони, захворювань слизової оболонки порожнини рота, включаючи пародонтоз. Дибунол є патогенетичним засобом для корекції метаболічних порушень при інфаркті міокарда.

Антиоксидантна активність виявлена також у представників різних класів лікарських речовин. Вивчена антиоксидантна активність ряду біогенних амінів. Встановлено, що рівень вільних радикалів у плазмі і еритроцитах людини значно знижується під впливом адреналіну.

Антиоксидантна активність характерна і для нейротропних препаратів. Так, оксипохідні аміназину мають антиоксидантну дію і гальмують ферментативне пероксидне окиснення в мікросомах головного мозку. Аналогічну дію виявлено й у дипразину. Антиоксидантну активність проявляють гормони тироксин і естрадіол.

Виявлена гальмуюча дія на пероксидне окиснення ліпідів у селенату натрію, що зв’язується з його участю в регуляції активності глутатіонпероксидази.

Як антиоксидантний засіб використовуються препарат Три-Vі-плюс (до складу входить вітамін Е, аскорбінова кислота, бета-каротин та селен).

Пероксиди ліпідів, як високотоксичні сполуки, викликають окиснення низькомолекулярних тіолових сполук і НS-груп білків, а, в свою чергу, сульфгідрильні сполуки організму (водорозчинні низькомолекулярні тіоли – цистеїн, глутатіон, арготіонеїн, тіоловмісні білки) виконують в клітинах функції антиоксидантів. Такі властивості природних сірковмісних антиоксидантів дозволяють допустити наявність подібної дії і у синтетичних препаратів, що містять НS-групи. Антиокиснювальні властивості виявлені в ряді моно- і дитіолів, в тому числі в унітіолу (2,3-димеркаптопропансульфат натрію). Механізм антиоксидантної дії унітіолу полягає в тому, що він як донатор НS-груп при введенні в організм виступає в ролі “пастки” вільних радикалів. Крім того, унітіол підтримує в клітині високий рівень відновленого глутатіону. Антиоксидантна активність виявлена у бісчетвертинних амонієвих сполук, зокрема, етонію, тіонію і додецонію    (І.Ф. Мещишен, 1991), що дало можливість рекомендувати етоній в комплексному лікуванні виразкової і променевої хвороби, токсичного гепатиту і хронічних панкреатитів (О.І. Волошин та ін., 1992). Отже, наявні на сьогодні дані дозволяють вважати перспективною можливість використання препаратів, які проявляють антиоксидантні властивості, в комплексному лікуванні захворювань, що супроводжуються активацією пероксидного окиснення ліпідів і зниженням активності фізіологічної антиоксидантної системи.

Препарати з антиоксидантною дією: унітіол, дибунол, тріовіт, мілдронат, тіотріазолін тощо.

 

 

 

 

Матеріали для самоконтролю:

  1. Вкажіть найпотужніший природний антиоксидант.

А. α-Токоферол;         В. Жирні кислоти;              С. Вітамін В1;

D. Глюкоза;                  Е. Гліцерол

  1. Стан антиоксидантної системи пацієнта оцінювали на підставі встановлення вмісту одного з ендогенних антиоксидантів. Якого саме?

А. α-токоферолу;        В. Перекису гідрогену;        С. Орнітину;       D. Холекальциферолу;         Е. Тривалентного Феруму

  1. У результаті оксидазних реакцій утворюється пероксид водню, який є токсичною речовиною для організму. Важливу роль у його відновленні відіграє глутатіон. Назвіть амінокислоти, які входять до складу глутатіону:

А. Глутамінова кислота, цистеїн, гліцин;    В. Ізолейцин, гістидин, аланін;   С. Лізин, метіонін, триптофан;   D. Аспарагінова кислота, валін, серин;       Е. Фенілаланін, лізин, тирозин.

  1. Пацієнту призначено препарат „Три- Vі-плюс”, до складу якого входить селен. Цей мікроелемент необхідний для функціонування такого антиоксидантного фермента як:

А. Глутатіонпероксидаза;    В. Каталаза;    С. Глутатіонредуктаза;  D. Супероксиддисмутаза;           Е. Церулоплазмін.

  1. У хворого встановлено ішемію міокарда, а для цього стану характерне ушкодження кардіоміоцитів унаслідок активації ПОЛ. Підвищення вмісту в міокарді яких речовин стимулює цей процес?

А. Катехоламінів;    В. Глутатіонпероксидази;    С. Токоферолу;     D. Супероксиддисмутази;             Е. Каталази.

  1. У хворого встановлена активація пер оксидного окислення ліпідів (ПОЛ). Чи зміниться при цьому процес окислювального фосфорилювання?

А. в результаті руйнування мітохондріальних мембран порушується окислювальне фосфорилювання та синтез АТФ;  В. відбувається паралельна активація окислювального фосфорилювання та синтезу АТФ;   С. активація ПОЛ суттєво не впливає на інтенсивність окислювального фосфорилювання та кількість АТФ не змінюється;  D. посилюються процеси окислювального фосфорилювання але тільки в мікротомах, тому відбувається активація монооксигеназ і диоксигеназ мікросомальної фракції;  Е. окислювальне фосфорилювання в дихальному ланцюзі активується, а на рівні субстратів пригнічується в результаті зміни активності відповідних ферментів.

  1. Одним із методів боротьби з гіпоксією є гіпербарична оксигенація. При недотриманні режиму висока доза кисню вигликає гостре отруєння з появою “кисневих” судом. Активація якої реакції небезпечна для тканин мозку при такій процедурі?

А. вільнорадикального окислення;          В. пероксидазної;  

С. оксигеназної;    D. оксидазної;    Е. мікросомального окислення.

  1. В процесі метаболізму в організмі людини утворюються активні форми кисню, в тому числі й супероксидний аніон-радикал. Цей аніон інактивується іонами водню за участі ферменту:

А. супероксиддисмутази;    В. каталази;     С. пероксидази;

D. глутатіонредуктази;    Е. цитохрому Р-450.

  1. Пероксидне окислення ліпідів відіграє велику роль при різноманітних патологіях. Прооксидантним механізмам протистоять антиоксидантні системи. Вкажіть компонент антиоксидантної системи.

А. глутатіон; В. карнозин; С. креатин;  D. соматомедин; Е. аспартат.

  1. Ті організми, котрі в процесі еволюції не створили систему антиоксидантного захисту від Н2О2 можуть існувати тільки в анаеробних умовах. Які з перерахованих ферментів можуть руйнувати пероксид водню?

А. пероксидаза та каталаза;                 В. оксигенази і гідролази;

С. цитохромоксидаза та цитохром b5;        D. оксигеназа та каталаза;

Е. супероксиддисмутаза та глутатіонпероксидаза.

 

Рекомендована література:

  1. Мещишен І.Ф., Пішак В.П., Григор”єва Н.П. Основи обміну речовин та енергії, 2005. –С.72-102.
  2. Губський Ю.І. Біологічна хімія, 2000. –С.192-194, 206-207, 217-224, 230-233.
  3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П. Біохімія людини, 2001. –С.384-393.
  4. Біологічна хімія / За ред. проф. Л.М. Вороніної, 2000. -С. 290-292, 313-314, 316-320.
  5. Бобырев В.Н., Почерняева В.Ф., Стародубцев С.Г. Специфические системы антиоксидантной защиты органов и тканей – основа диференциальной фармакотерапии//Эксперим. и клин. фармакология. -1994. -Т.57,31. -С.47-54.
  6. Бєленічев І.Ф., Коваленко С.І., Дунаєв В.В.Антиоксиданти: сучасні уявлення, перспективи створення//Ліки. -2002. -№1-2. -С.43-46.
  7. Волков В.И. Атеросклероз и атеротромбогенез, клинические проявления и лечение (лекция)//Лікування і діагностика. -2002. -№2. –С.13-22.
  8. Киричек А.Т., Зубова Е.О. Молекулярные основы окислительного стресса и возможности его фармакологической регуляции//Международ. мед. журн. -2004. –Т.10, №1. –С.144-147.
  9. Почерняева В.Ф., Цебржинский О.И., Шиш Н.В. Прооксидантно-антиоксидантный гомеостаз//Буковинський мед. вісник.-2005.-№2.–С. 212-214.
  10. Дворецкий Л.И., Заспа Е.И., Литвицкий Р.Ф. Свободнорадикальные процессы у больных с железодефицитной анемией на фоне лечения препаратами железа//Тер. архив. -2006. –Т.78, №1. –С. 52-56.
  11. Дубинина Е.Е., Пустыгина А.В. Окислительная модификация протеинов, ее роль в патологических состояниях//Укр. біохім. журн. -2008.-№5,Т.80.–С.5-18.

 

ЗАВАНТАЖИТИ

Для скачування файлів необхідно або Зареєструватись

ПЕРОКСИДНЕ ОКИСНЕННЯ ЛІПІДІВ ТА БІОПОЛІМЕРІВ АНТИОКСИДАНТИ (113.2 KiB, Завантажень: 1)

завантаження...
WordPress: 23.02MB | MySQL:26 | 1,114sec